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本试剂盒和传统的T4连接酶原理不同，利用了Topoisomerase可以在瞬间（几秒钟至几分钟）、高效（接近100%）连接DNA片段的原理，采用独特的工艺制成。

本试剂盒在克隆插入位点两侧不含多克隆酶切位点（Simple），需要时可在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行酶切时，酶切反应将不会受到载体上其它多克隆酶切位点影响，可大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。

• 可以在瞬间（几秒钟-几分钟）完成A末端PCR产物连接。
  
• 特制的新型载体质粒大小仅仅不到2kb，充分发挥了TOPO载体越小，可容纳片段越大的优势，最大限度提高了大片段连接效率；连接后质粒大小比传统载体小2kb以上，质粒越小，转化效率越高，极大的提高了各种片段连接后的转化子数量。
  
• 采用氨苄抗性载体只需0～10分钟复苏时间，比卡那抗性载体1小时复苏时间缩短6倍。
  
• 最快可以省略1小时复苏步骤，热休克冰浴后，不用加LB复苏，直接将感受态涂板即可。从连接到涂板全程只需15分钟。
  
• 自杀基因零背景原理，无自连假阳性，无需繁琐蓝白斑筛选和菌落PCR筛选。大部分情况下随机挑一个克隆便是有插入的（接近100%）。
  
• 连接长片段能力远超传统TA克隆载体，可连接长达10kb片段（例如连接5kb片段，也可能达到挑10个菌落，至少8个是有插入的效果）。

本TOPO载体连接体系按照10μL一次计算可以用20次，如果按照其它公司产品5μL一次计算，使用次数可以增加一倍，20次可用40次。

• 连接反应的准备：
  PCR引物使用正常设计的引物即可，不需做任何改变（不能用磷酸化引物）。使用能在PCR产物末端加一个突出的3'-A的酶系列扩增（如Taq、LA Taq、F8 Mix、Taq Mix）。PCR产物一般建议胶回收纯化（货号：ALH096)，这样可以避免后续可能的问题。如果PCR产物仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体，也可尝试直接进行连接反应。如果是以质粒为模板的PCR产物则最好进行纯化，因为模板质粒也可能长出菌落（但不是想构建的目的载体）。
  
• 连接反应：
  
  • 配制反应体系：
    
    • 室温设立10μL连接体系（建议用0.2mL PCR管，PCR仪器控温）：
      

      成分	用量
      纯化后的PCR产物/或者1μL 1000bp Control	0.5～5μL
      pTOPO-TA Simple Vector	1μL
      10×Enhancer	1μL
      灭菌水	X μL
      总体积	10μL

      • 如果使用5μL体系连接，各成分按照比例减半使用，使用次数可以加倍。
        
      • 不同大小插入片段的推荐用量（注意过量太多了，反而导致转化子减少）：
        

        插入片段大小(bp)	推荐用量(ng)
        100～1000	10～40
        1000～2000	40～80
        2000～5000	80～180

    • 加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底。
      
      • 反应体系配制过程不能在冰上进行，只能在室温（25℃～37℃）进行。
  • 反应程序：37℃连接5分钟（建议置PCR仪器上控温）。
    
    • 本载体推荐室温（25℃～37℃）5分钟完成连接。长片段或者连接困难片段可以延长连接时间到10～15分钟，温度可选37℃，可显著增加转化子数量。
  • 连接产物置于冰上备用。立即接标准的感受态转化步骤或快速转化步骤。
• 快速转化：
  
  • 感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰浴中，解冻融化（约1～3分钟左右）。
    
  • 立刻加入5μL连接液(最多可10μL连接液全加入，只要体积不超过感受态细胞体积的1/10)，手指拨打（Flick）离心管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰浴放置5分钟。
    
  • 热休克：42℃水浴热休克1分钟，迅速放回冰浴静置2～3分钟，该过程不要摇动离心管。
    
    • 本公司技术连接效率比竞争对手高10～100倍，所以如果后续发现转化子很多，甚至长糊板子，做完热休克步骤后，可以省略步骤4（复苏），直接将热休克冰浴后的感受态细胞涂板，培养过夜即可。这样从连接到涂板全过程仅需要15分钟，超快速流程极大的简化了操作，缩短了时间。
  • 复苏（可选步骤）：加500μL LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃ 200rpm振荡培养10～20分钟。
    
    • 根据我们的经验，一般可以直接将培养基（如从冰箱取出温度低，应事先置37℃温箱回温至22℃～37℃）加入到感受态细胞的1.5mL离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可，不需要转移到试管培养复苏。
      
    • 一般商品化的感受态细胞不超过2kb插入片段情况下，热休克后10～15分钟复苏可以得到足够多转化子，如果使用实验室自制的感受态效率低、或者转化子少、插入片段长的情况下可以提高复苏时间到30～60分钟以得到更多的转化子。
      
    • 本公司技术连接效率比竞争对手高10～100倍，追求最简单最快速的用户可以尝试省略步骤4（复苏），直接将热休克冰浴后的感受态细胞涂板，培养过夜即可。熟悉超快速流程后，以后这样从连接到涂板全过程仅需要15分钟，超快速流程极大的简化了操作，缩短了时间。
  • 取100～200μL菌液涂板(培养板含氨苄青霉素100μg/mL），培养过夜。
• 转化子的筛选鉴定：
  本制品采用自杀基因零背景原理，无插入自连的细菌会自杀无法生长，因此几乎没有假阳性，一般情况下，可以达到所见即所得，只要是长出来的菌落正常（不是污染的杂菌，转化子数量也不算太少），基本就100%包含插入。因此插入片段不超过2～3kb的情况下强烈建议不做菌落PCR鉴定，直接挑1～2个菌去测序。
  
  • 一般本公司TOPO载体阳性率非常高，所以菌落生长正常，数量也不是太少的情况下建议直接去测序（强烈建议不做菌落PCR筛选）。
    • 测序引物不能采用M13(-47)/M13(-48)通用引物测序，只能采用M13F/M13R通用引物测序（见后面图谱）。
  • TOPO载体的菌落PCR结果容易出现假阴性（就是菌P失败显示没有插入或者扩增大小不对，实际却是有插入的）。因此在使用菌P鉴定的情况下，如菌P结果阳性，一般可以相信此结果。如结果是阴性，或者显示扩增出大小和预期不符合，一般不可相信，要考虑到菌P结果假阴性的可能，需要直接去测序鉴定，测序成功的完成实验；测序不成功的可以进一步提取质粒跑电泳看大小，或者酶切鉴定来确认。
    
  • 用上述培养的白色菌落的菌液抽提质粒，插入片段较大的情况下，直接跑电泳看质粒大小就直接能鉴定出有插入的质粒，还可用载体骨架上酶切位点如ApaI/BglI/BsaHI，或者插入片段上引入的酶切位点酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，确定是否含有目的片段。